Мікробіологічна деструкція світлих вуглеводневих палив

Примаченко С. В., Кирик Т. І. 
Україна, Київ, Національний авіаційний університет 

Установлено, что в жидких углеводородных средах, при определенных условиях могут жить, размножаться и преобразовывать среду жизнедеятельности, разные группы микроорганизмов. В данной работе на основе литературных источников приведена характеристика бактерий и микроскопических грибов, которые были выявлены в образцах авиационного бензина, и рассмотрен пример биохимического преобразования углеводородных цепей n–алканов.

Огляд мікроорганізмів, здатних до засвоєння n–алканів
Очевидно, що не існує «універсального» мікроорганізму, який би міг використовувати всі групи вуглеводнів, що входять до складу бензинів, як субстрат для живлення і забезпечення процесів метаболізму. На основі літературного огляду, в даній роботі наведена характеристика основних груп мікроорганізмів, здатних споживати деякі насичені вуглеводні. Встановлено, що бактерії, здатні засвоювати n–алкани, належать до наступних родів: Pseudomonas, Clostridium, Micrococus, Mycobacterium, Brevibacterium, Bacillus, Flavobacterium, Alcaligenes [1]. Також у вуглеводнях були виявлені мікроскопічні гриби Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Candida, Picia. Більшість колоній бактерій, наявних у  вуглеводневих сумішах, в основному була зосереджена на межі фаз вода — алкани. У 740 штамів бактерій досліджена властивість рости на рідких вуглеводнях — нафті, дизельному паливі і бензині. На середовищах з нафтою розвивалися 29,7% штамів, з дизельним паливом – 18,9%, з парафіном – 46,2%  [5].
БАКТЕРЇЇ
Рід Pseudomonas. Представники роду належать до групи грамнегативних аеробних бактерій. Мікроорганізми мають паличкоподібну форму, розміри клітин в діапазоні 0,5-1,0 × 1,5-5,0 мкм і є достатньо різноманітними за культуральними і фізіологічними ознаками. Спор не утворюють, мають полярно розташовані джгутики (кількість джгутиків різниться залежно від виду). Хімічний склад клітинної стінки бактерій постійний і, як правило, не змінюється на різних стадіях розвитку або при виникненні мутацій. Більшість представників роду мають гетеротрофний тип обміну речовин, тобто для забезпечення процесів метаболізму їм необхідні органічні сполуки. Біохімічні  процеси здійснюються за рахунок обміну окиснювального типу, де кисень є кінцевим акцептором електронів, перенесення яких пов'язане з системою цитохромів. Деякі представники цього роду можуть існувати за рахунок анаеробного нітратного дихання, інші використовують енергію окислення водню [6]. У бактерій даного роду відсоток Г––Ц (гуанін––цитозин) в ДНК коливається в межах 58-69 %, що важливо для методу РЛР (полімеразно-ланцюгових реакцій)  ідентифікації представників роду.
Під час лабораторного культивування групи клітини часто об'єднуються в невеликі грудочки або зерна, оточені товстою слизовою оболонкою. Колонії бактерій дуже різноманітні: слизові і пастоподібні, опуклі і плоскі, великі і дрібні. У багатьох видів відзначається внутрішня структура колоній. Якщо їх розглядати в мікроскопі за малого збільшення, то в одних випадках можна виявити дрібнозернисту колонію; у інших - комірчасту або у вигляді грудочок. Однак, більшість видів мають колонії, які  під мікроскопом виглядають як однорідна гомогенна маса. Бактерій роду Pseudomonas культивували  на середовищах з n–гексадеканом, гасом та інших нафтових паливах, при чому були зареєстровані продукти деструкції вуглеводнів за рахунок дії ферментативних комплексів видів P. aeruginosa (рис. 1.) та  P. metanica (рис. 2.) [2]. 

рис.1. Pseudomonas aeruginosa	рис.2. Pseudomonas metanica	

Рід Flavobacterium.  Представники належать до групи грамнегативних аеробних або мікроаерофільних паличок. Всі види роду є хеморганотрофами (для забезпечення метаболізму необхідні органічні сполуки). Розмір клітин  0,5 × 1,0-3,0 мкм, на щільних агаризованих середовищах формують жовті (від кремових до помаранчевих) колонії, споживають кілька полісахаридів та n–алканів [1] широко поширені в ґрунті, прісноводних водоймах, м’ясі, молоці та інших продуктах. Відомі патогенні види. Вид F. psychrophilum (Рис.3) був виділений з бактеріального консорціуму під час досліджень біогенної деструкції вуглеводнів в ґрунті та водному середовищі [1].
	
рис. 3. Flavobacterium psychrophilum	

Рід Clostridium. Представники належать до групи грампозитивних паличок, що утворюють ендоспори, анаероби. Розміри клітин достатньо великі 0,3-2,0 × 1,5-20 мкм. Клітини мають закруглені або загострені кінці, розташовані поодиноко, парами або утворюють короткі ланцюжки. Молоді клітини рухливі, мають перитрихіально (вздовж усієї клітини) розташовані джгутики, плазма їх гомогенна. При старінні клітини плазма стає гранульованою. В середині клітини (в центрі або ближче до її кінця) формується овальна або сферична ендоспора, яка в поперечному перерізі значно ширша, ніж вегетативна клітина, і тому клітина в цей період набуває форми веретена. Середній діаметр спор становить 1,3 – 1,6 мкм. 
Діапазон температур, за яких розвиваються ці бактерії, достатньо широкий, для більшості видів зона толерантності охоплює 10-65 °С. Зустрічаються як мезофільні, так і термофільні форми. Для мезофільних видів температурний оптимум знаходиться в діапазоні 25-30 °С, а межа максимальних температур 37-45 °С. Молекулярний азот фіксують лише мезофіли [6]. Клостридії відносно стійкі до варіацій рН середовища. Діапазон значень рН, за якіх їхній розвиток протікає нормально становить від 4,5 до 9. Вплив водного режиму на розвиток бактерій роду Clostridium вивчений досить повно [2]. Будучи облігатними анаеробами, вони добре переносять високе насичення ґрунту водою, проте оптимальна межа зволоження визначається типом ґрунту і вмістом гумусу. В більшості випадків клостридії добре розвиваються за вологості ґрунту 60-80% від його повної вологоємності. Типовими представниками роду, є C. acetobutylicum, C. botulinum (рис. 4), C. difficile, що викликають тяжкі захворювання рослин, тварин і людей.
	
рис. 4. Clostridium botulinum	

Представники роду були виявлені у сирій нафті [2]. Також при дослідженнях нафтових забруднень ґрунту серед консорціуму мікроорганізмів-деструкторів нафти були виявлені види роду Clostridium [1].
Рід Bacillus. Представники належать до групи грампозитивних паличок, що утворюють ендоспори, хемоорганотрофи. Види роду є аеробами і факультативними анаеробами. Вегетативні клітини мають вигляд прямих паличок з паралельними сторонами і округлими або обрубленими кінцями розміром 0,5-2,5 × 1,2-10 мкм. Клітини добре забарвлюються звичайними аніліновими барвниками. Витривалість до підвищених температур, змін рН та солоності середовища варіює у різних видів. У багатьох видів відзначається наявність внутрішньоклітинного жиру, глікогену, волютину та інших включень [6].  Вид B. termophil (Рис. 5) був випробуваний у якості деструктора n–гексадекана [2].
	
рис. 5. Bacillus termophil	

Рід Micrococcus.  Представники належать до групи грампозитивних коків, спори не утворюють. Поширені в широкому діапазоні умов, виявлені у повітрі, грунті, на харчових продуктах, на шкірі ссавців, є облігатними аеробами. Бактерії мають сферичні клітини, діаметром 0,5 – 2 мкм розташовані парами або тетрадами, інколи об’єднані в скупчення неправильної форми, але ніколи не утворюють ланцюжки. Є безбарвні види, інші мають пігменти помаранчевого, жовтого або червоного кольору. Хемоорганотрофи, в  основному представлені сапрофітними формами. Патогенних видів не виявлено. У більшості видів оптимум температури – в межах 25–30° C, однак  для M. cryophilus оптимальною є температура 10°C. Більшість видів добре переносять недостню кількість вологи та різке підвищення температур [6]. Представники роду Micrococcus були виявлені в консорціумах, що розвивались на субстратах, таких як гербіциди, хлоровані біфеніли, нафта та нафтопродукти [3]. Показано, що M. karificans (рис. 6), розкладають субстрати з наявністю n–гексадекана, n–алканів C18–C19[2]. 
	
рис. 6. Micrococcus karificans	

Рід Mycobacterium. Належать до групи мікобактерій, аеробні, паличкоподібні, стійкі до кислот, слабо зафарбовуються за Грамом (слабогрампозитивні). Представники роду прямі або слабо зігнуті палички розміром 0,2-0,7 × 1,0-10 мкм, інколи утворюють нитки подібні міцелію. Рід містить кілька відомих патогенних форм, здатних викликати серйозні захворювання, наприклад туберкульоз. Нездатні утворювати спори та капсули, нерухомі за виключенням M. marinum, здатного рухатися в середині клітин лейкоцитів. Хемоорганотрофи, ростуть повільно (поява видимих колоній можливива через 20-60 діб від початку культивування.
Мікобактерії характеризуються здатністю розкладати вуглеводні, і ця властивість, як виявилося, властива багатьом видам. Насьогодні  виділено близько 20 видів парафінокиснюючих мікобактерій. Найбільш поширеними є M. lacticolum 
(рис. 7), M. paraffinicum (рис. 8), M. rubrum, M. luteum,M. mucosum [6].
		
рис. 7. Mycobacterium. lacticolum	рис. 8. Mycobacterium paraffinicum	
ГРИБИ
Рід. Aspergillus. Представники належать до аскомікотових (сумчастих) грибів. Це плісняві мікроскопічні гриби, які добре ростуть на різних субстратах, у тому числі за наявності  n–алканів як єдиного джерела вуглеводнів [5]. Утворюють плоскі пухнасті колонії, спочатку білого кольору, а потім, залежно від виду, вони приймають різне забарвлення, пов'язане з продуктами метаболізму гриба і спороношенням (рис. 9). Аспергіли мають щільний багатоклітинний (септований) міцелій, характерний для вищих грибів. Розмноження вегетативне – конідіями або нестатеве – аскоспорами. Сумки з аскоспорами – сферичної або еліптичної форми. Як виключення для даної групи у A. fumigatus встановлене статеве розмноження [4]. Плісняві грибки широко поширені в природі від приполярних широт до тропіків на широкому спектрі субстратів, є витривалими до дій зовнішнього середовища. Зазвичай зустрічаються в ґрунті, де розкладають органічні рештки. Також розвиваються на харчових продуктах, утворюючи білу, сіру та зелену плісняву, пошкоджують вироби з пластику і навіть металу. Деякі види викликають захворювання дихальних шляхів людини та тварин – аспергильози.

рис. 9. Aspergillus (спороношення)	

Рід Candida.  Представники також належать до аскомікотових грибів, однак мають спрощену будову на відміну від аспергілових.  Є дріжджовими грибками, не мають справжнього міцелію, колонії представлені відокремленими клітинами. Розмножуються вегетативно брунькуванням, а сумки з аскоспорами виглядають як окремі клітини. Добре відомий вид C. albicans є патогенним, викликає кандидоз — захворювання людини та тварин. У C. аlbicans (рис. 10) виявлена здатність до деструкції парафінів і гасу [4], їх часто виявляють в середовищах мікробіологічної переробки нафти [1]. Представники роду Candida, такі як: C. аrborea, C. іntermedia, C. guilliermondi, C. tropicalis (рис. 11), C. lipolitica (рис.12), мають здатність розкладати вуглеводні з довжиною ланцюга C10–C20. [2].
		
рис. 10. Candida albicans	рис. 11. Candida tropicalis	
		
рис 12. Candida lipolytica		

Загальний огляд біохімічних процесів розкладання вуглеводнів палива мікобактеріями
Розглянемо узагальнений механізм хімічного перетворення парафінів бактеріями  роду Mycobacterium. Окиснення вуглеводнів ферментативними комплексами мікроорганізмів є рядом ланцюгових реакцій, що проходять одна за одною, кінцевими продуктами процесу є вищі насичені жирні  кислоти: 
Реакція починається з розкладання вуглеводневого ланцюга:
СН3—(СН2)n—СН2—СН3                (1)
В якості проміжних продуктів утворюються спирти, потім альдегіди. 
СН3—(СН2)n—СН2—СН2ОН           (2)
СН3—(СН2) n—СН2—СНО               (3)
Процес завершується утворенням кислот. 
СН3—(СH2) n—СН2—СООН                (4)

Найважливішим в цьому ланцюзі реакцій є перший етап окиснення молекули вуглеводню. Первинне окиснення парафінів бактеріями може йти двома шляхами:
1) в окиснювану молекулу вуглеводню вводяться два атоми кисню, утворюється гідропероксид, який потім перетворюється на спирт: 
СН3—(СН2)n—СН3 + O2→                               
СН3—(СН2)n—СН2—O—ОН + H2 →          
СН3—(СН2)n — СН2ОН + Н2O
2) в окиснювану молекулу вуглеводню вводиться один атом кисню, з утворенням спирту: 
СН3—(СН2)n—СН3 + O + H2 →                      
СН3—(СН2)n —СН2ОН + Н2О                            
Шлях окиснення вуглеводнів визначається тим, наскільки середовище насичене киснем, наприклад від інтенсивності аерації. Спирти і альдегіди є проміжними продуктами окиснення вуглеводнів, і вони не накопичуються в клітинах мікроорганізмів. Кінцевим продукт окиснення, як вже було згадано, є кислоти. За допомогою методу газорідинної хроматографії виявлено, що при окисненні високомолекулярних парафінів в клітинах бактерій зазвичай накопичуються жирні кислоти з таким ж числом вуглецевих атомів, яке мав початковий вуглеводень. У меншій кількості є присутніми кислоти, вуглецеві ланцюги яких укорочені на кілька вуглецевих фрагментів. Так, в клітинах Mycobacterium paraffinicum, що окиснює вуглеводень гексадекан С16Н34, містяться наступні жирні кислоти пальмітинова C15H31COOH  (74 %) , маргаринова С16Н33COOH (18%), лауринова С11Н23COOH (6%) і капринова С9Н19СОOН (2%). Жирні кислоти у вільному стані містяться в клітинах у невеликій кількості. Частину утворених кислот бактерії використовують для синтезу власних клітинних ліпідів. Інша частина жирних кислот розщеплюється до низькомолекулярних сполук, які йдуть на синтез білків, вуглеводів і інших необхідних речовин. Ліпіди бактеріальних клітин представлені триацилгліцеридами, восками та низкою специфічних сполук. Так, триацилгліцериди, виділені з клітин M. paraffinicum, що росли на субстраті з додаванням гексадекану, є складними ефірами гліцерину і трьох жирних кислот – пальмітинової, маргаринової і лауринової.  Причому суміші переважав трипальмітин. Дана сполука є складовою багатьох харчових продуктів, наприклад вершкового масла. Воски – це також складні ефіри, утворені вищими жирними кислотами і спиртами. Деякі види бактерій накопичують в клітинах велику кількість воску. Наприклад, культура M. сeroformans, при вирощуванні на середовищі з гексадеканом, накопичує у великих кількостях цетилпальмітат, який утворюється з цетилового спирту і пальмітинової кислоти [6].

Список використаної літератури:

1.	Квасников Е. И.  Микроорганизмы — деструкторы нефти в водных бассейнах / Е.И. Квасников, Т.М. Клюшникова — Киев : Наук. Думка, 1981. — 132 с.
2.	Антипчук А.Ф. Водна мікробіологія /  А.Ф Антипчук, І. Ю.Кірєєва. – К: 2005. — 256 с.
3.	Моисеева Л.С. Биокоррозия нефтегазопромыслового оборудования и химические методы ее подавления. Ч.1 / Л.С. Моисеева, О.В. Кондрова // Защита металлов. — 2005. — Том 41, № 4. — С. 417—426.
4.	Мир растений. В 7 т. / Тахтаджян А. Л. (гл. ред.), под ред. Горленко М. В. (Т.2). — М. : «Просвещение», 1991. — Т. 2. Грибы. — С. 370—375.
5.	Литвиненко С. Н. Защита нефтепродуктов от действия микроорганизмов. – М : Химия, 1977. — С. 24—28.
6.	Жизнь растений. Т. 1. Введение. Бактерии и актиномицеты / Н.А. Красильников,  А.А. Уранов [ред.] — М. : «Просвещение», 1974. – 551 с.